Przygotowanie sond hybrydyzacyjnych za pomocą reakcji PCR jest procesem bardzo wydajnym i powtarzalnym. Stosując niewielkie ilości DNA - plazmidowego lub genomowego można otrzymywać w stosunkowo krótkim czasie, znacząca ilość specyficznych sond wyznakowanych fluoresceiną. Wykorzystanie reakcji PCR do znakowania DNA wymaga tylko niewielkiej ilości materiału wyjściowego. Czystość DNA użytego do reakcji, w przeciwieństwie do random priming, nie odgrywa kluczowej roli. Wyznakowanie DNA za pomocą reakcji PCR umożliwia oszacowanie ilości produktu, nawet w przypadku bardzo niskiej wydajności reakcji amplifikacji, gdy ilość produktu jest abyt niska aby standardowo wykryć go bromkiem etydyny.

 Wpływ modyfikacji nukleotydów na wydajność produktu PCR

Budowa i rozgałęzienie dUTP z przyłączoną fluoresceiną nie wpływa znacząco na wydajność włączania zmodyfikowanego nukleotydu  do łańcucha DNA jednakże należy być świadomym że tego typu reakcje wymagają szczególnych warunków charakterystycznych dla reakcji znakowania DNA.

Ilość modyfikowanych nukleotydów niezbędna do przygotowania sond

Sondy hybrydyzacyjne powinny charakteryzować się maksymalnie wysoką ilością wbudowanej wyznakowanej zasady, stąd ważne jest  aby ilość fluorescein-12-dUTP w mieszaninie dNTP, była wysoka. Należy jednak pamiętać, że jeżeli dTTPs zostaną całkowicie zastąpione w mieszaninie przez modyfikowane zasady, ilość produktu może krytycznie obniżyć się. W celu znalezienia optymalnej proporcji sprawdzono mieszaniny w którym stosunek zasad fluoresceina-12-dUTP : dTTP wynosił 1:2, 1:3 i 1:10.
W eksperymencie tym otrzymano najlepsze specyficzne włączanie modyfikowanego nukleotydu przy stosunku 1:2. Prawie takie samo specyficzne włączanie otrzymano przy zastosowaniu proporcji 1:3. Specyficzne włączanie w stosunku 1:10 było bardzo niskie. W związku z powyższymi wynikami oraz aspektami ekonomicznymi i praktycznymi uznano, że optymalny skład mieszaniny powinien opierać się na stosunku 1:3.

Wpływ włączania modyfikowanego dUTP na wydajność reakcji PCR i mobilność produktów w żelach agarozowych.

Analiza otrzymanych produktów reakcji PCR znakowanych przy użyciu zasady fluoresceina-12-dUTP wykazała, że wydajność reakcji jest znacznie niższa w porównaniu do standardowej reakcji PCR. Produkty z włączonym znacznikiem fluoresceina-12-dUTP mają obniżoną mobilność w żelu agarozowym w porównaniu do produktów PCR otrzymanych przy standardowej mieszaninie dNTPs. Zaobserwowano również, że termostabilne polimerazy Taq, Pfu, Tth) włączają fluoresceina-12-dUTP z różną wydajnością. Polimerazy Taq i Tth  włączają modyfikowaną zasadę (30x) mniej wydajniej niż polimeraza Pfu, podczas gdy ilość produktu reakcji PCR przy użyciu tych polimeraz jest praktycznie taka sama.

zdj 1. Efekt włączania fuloresceina-12-dUTP do produktu PCR (2% agaroza barwiona bromkiem etydyny).

M – marker 100 pz (Novazym Polska)

1. produkt reakcji PCR (AllegroTaq polimeraza DNA, Novazym Polska)
2. produkt reakcji PCR z zasadą flouresceina-12-dUTP otrzymany przy pomocy Pfu polimerazy. (PrestoPfu polimeraza DNA, Novazym Polska)
3.  produkt PCR z włączoną modyfikowaną zasadą flouresceina-12-dUTP otrzymany przy pomocy Taq polimerazy. (AllegroTaq polimeraza DNA, Novazym Polska)

Mobilność produktu otrzymywanego przy użyciu Pfu polimerazy jest wolniejsza, co wskazuje, że ilość włączonych modyfikowanych nukleotydów w przypadku tej polimerazy jest znacznie większa.

Protokół reakcji PCR z modyfikowanymi nukleotydami umożliwiający otrzymanie sond znakowanych fluoresceiną lub biotyną w reakcji PCR.

 fluoresceina-12-dUTP (1:3) (150 µМ dATP, dCTP, dGTP, 100 µМ dTTP, 50 µМ fluorescein-12-dUTP).

Do przygotowania mieszaniny reakcyjnej należy użyć następujących składników reakcji:

- 4 ul mixu fluoresceina-12-dUTP (1:3)                                                                   
- 2,5 ul buforu AllegroTaq polimerazy (x10)
- 1 ul każdego ze starterów reakcji PCR o stężeniu 1-10 uM
- AllegroTaq polimeraza 0,5-2,5u na obj. końcową 25 ul mieszaniny.
- matryca DNA 0,02-0,15ug na obj. końcową 25 ul mieszaniny.
- woda do reakcji PCR do 25 ul

Parametry cyklu reakcji PCR:

94ºC – 10 sek.
37-68ºC – 10 sek.
72ºC – 10-60  sek. (w zależności od długość produktu)

Liczba cykli: 40
Inkubacja po ostatnim cyklu: 72ºC, 3 min

Warunki reakcji powinny być ustalone przede wszystkim empirycznie. Produkt reakcji PCR powinien być przechowywany w temp. 4ºC, lub dla dłuższego okresu czasu w temp. -20ºC
-70ºC. Po wykonaniu reakcji PCR zalecamy, aby sprawdzić produkt PCR na żelu.

Produkt dostępny wkrótce	nr kat	Ilość	sklep internetowy
Fluroesceino-12-dUTP	FL1000-01	reak.

 

UWAGA! Ograniczenia w zastosowaniu: Te produkty zostały zaprojektowane i wykonane wyłącznie do celów badawczych. Nie został przetestowany w kierunku zastosowania do celów diagnostycznych i do bezpośredniej produkcji leków oraz do celów związanych z produkcją leków.