Zestaw VerteKIT - protokół reakcji

W poniższym protokole chcielibyśmy zaproponować zoptymalizowaną procedurę reakcji odwrotnej transkrypcji. Jednakże w zależności od sytuacji zalecamy wprowadzenie odpowiednich modyfikacji i dostosowanie poniższej procedury do indywidualnych potrzeb.

Protokół prowadzenia reakcji:

 1. W probówce umieszczonej w lodzie i zmieszać następujące skadniki reakcji:

2. Starannie wymieszać a następnie zwirować

3. Mieszanine inkubować 5 min 70C a następnie umieścić próbówkę w lodzie. Po schłodzeniu zwirować.

4. Umieścić probówkę w lodzie i dodać następujące reagenty:

5. Inkubować mieszaninę 60min + 37C (w przypadku zastosowania random primers należy przeprowadzić inkubację wstępną w + 25C przez 10 min., a następnie + 37C 60 min).

6. W celu zakończenia reakcji mieszaninę inkubować 10 min, + 70C, a następnie umieścić w lodzie.

Zalecenia:

• wykorzystanie poli(A)+ RNA zamiast RNA total pozwala istotnie podnieść specyficzność i efektywność reakcji syntezy cDNA.
• W przeciwieństwie do zastosowania starterów losowych (random primers) startery oligo d(T)15 nie wymagają szczególnej optymalizacji warunków reakcji. Należy zwrócić uwagę na współzależność pomiędzy stężeniem starterów losowych a matrycą, od której zależy długość cDNA. Zwiększenie stężenia losowych starterów prowadzi do syntezy krótkich (około 600 nukleotydowych) cDNA, natomiast zmniejszenie stężenia będzie sprzyjać syntezie dłuższych odcinków cDNA.
• Problemy związane z obecnością struktury drugorzędowej RNA bogatej w GC można zmniejszyć poprzez odpowiednie podniesienie temperatury reakcji do +45C lub poprzez dodanie DMSO do mieszaniny reakcyjnej. Należy jednak pamiętać, że może to doprowadzić do zmniejszania wyjściowej ilości cDNA.