"One Step" RT KIT
Protokół prowadzenia odwrotnej transkrypcji i amplifikacji
DNA w jednym etapie reakcji (v.5.23.04.19)
 - Protokół w formacie pdf.
W poniższym protokole proponujemy optymalną procedurę reakcji odwrotnej transkrypcji w jednym etapie reakcji. Jednakże w zależności od sytuacji zalecamy wprowadzenie odpowiednich modyfikacji i dostosowanie poniższej procedury do indywidualnych potrzeb.
Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzi się z wykorzystaniem różnorodnych typów starterów, niemniej w w przypadku jednoetapowej reakcji zalecamy zastosowanie starterów specyficznych dla badanej sekwencji RNA.
Protokół prowadzenia reakcji:
1. W probówce umieszczonej w lodzie zmieszać następujące komponenty reakcji:
Protokółł reakcji
składniki reakcji |
Ilość |
| MATRYCA RNA |
2ul |
lub |
total RNA |
0,1-5ul |
| poli (A)*RNA |
0,5-10ng |
| specyficzny RNA |
0,01pg i mniejsze |
| STARTERY (specyficzne 15-20pM) |
|
lub |
STARTER 1 |
1ul |
| STARTER 2 |
1ul |
| Woda, wolna od RNAz |
do 18ul |
2. Starannie wymieszać a następnie zwirować
3.Mieszaninę inkubować 5 min 70 0C a następnie umieścić próbówkę w lodzie. Po schłodzeniu zwirować.
4. Umieścić probówkę w lodzie i dodać następujące składniki reakcji:
Protokół reakcji odwrotnej transkrypcji
| Składniki reakcji |
Ilość |
| (x10) bufor polimerazy "One step" |
2,5ul |
| 1.5mM dNTPs mix |
4ul |
| One Step Polimeraza |
1ul |
4. umieścić probówkę w amplifikatorze i ustawić parametry pracy wg. poniższego schematu:
- 60 min inkubacja w temp. + 37 °C,
- następnie, 5 min w temp. + 94 °C,
- cykl amplifikacji DNA, optymalny dla danego fragmentu.
|
Twój Partner w Biotechnologii
