Odwrotna transkrypcja:

Dostępne produkty:

Odwrotne transkryptazy:

Produkt	link
Odwrotna transkryptaza Verte M-MLV, 200u/ul
Odwrotna transkryptaza HIV

Zestawy odczynników do reakcji odwrotnej transkrypcji:

Produkt	link
Zestaw VerteKIT
Zestaw VertePlus

Odwrotna transkrypcja:

Odwrotna transkrypcja jest techniką rutynowo stosowana podczas pracy z RNA w laboratoriach molekularnych. W reakcji odwrotnej transkrypcji wykorzystuje się właściwości niektórych polimeraz DNA zależnych od RNA do syntezy nici cDNA (complementary DNA) na RNA jako matrycy.Odwrotna transkrypcja jest najczęściej wstępnym etapem poprzedzającym inne techniki molekularne takie jak:

- reakcję PCR
- reakcję klonowania,
- techniki hybrydyzacyjne,
- analizę miejsc restrykcyjnych

Pierwszym etapem procedury jest przepisanie RNA na cDNA (complementary DNA) przy pomocy enzymu odwrotnej transkryptazy.

Najczęściej stosowanym enzymem w tej technice jest odwrotna transkryptaza mysiego wirusa leukemii Moloneya M-MLV.

Verte M-MLV jest odwrotną transkryptazą produktem genu pol Mysiego Wirusa Leukemii Moloneya. Umożliwia syntezę cDNA o długości do 5kpz. Idealna do przeprowadzania standardowej reakcji RT-PCR (reverse transcription PCR). W pierwszym etapie reakcji na matrycy RNA odbudowuje komplementarną pojedynczą nić DNA (tzw. first stand). Działa z różnymi rodzajami starterów:

1.startery specyficzne dla znanej sekwencji genomu (GSP)

2.startery oligo(dT)–hybrydyzujące do charakterystycznej dla mRNA sekwencji polyA. Ponieważ mRNA stanowi mniej niż 5% całkowitego RNA w komórce ilość syntezowanego cDNA jest mniejsza niż w przypadku całkowitego RNA. W tym przypadku nie jest konieczna optymalizacja ilości startera względem matrycy.więcej

3.hexamery (6-ciomery) tzw. Random Hexamer Primers (RH) – amplifikujące losowe fragmenty RNA o rożnej długości (szczególnie przydatne w technikach fingerprinting). Reakcję z heksamerami wykonuje się w przypadku nieudanych prób syntezy i amplifikacji innymi metodami. W tym przypadku stężenie starterów ma istotny wpływ na długość otrzymanego cDNA. W tym przypadku najczęściej konieczne jest czysto empiryczne ustalenie ilości startera w stosunku do matrycy.więcej

W odróżnieniu od odwrotnej transkryptazy AMV (Avian Mieloblastosis Virus) M-MLV posiada tylko szczątkową aktywności RNAazy H. Aktywność RNAzy H przejawia się specyficzną degradacją nici RNA w hybrydach RNA:DNA. Aktywność RNAzy H może nie wywierać znaczącego wpływu na ilość DNA, jeżeli całość syntezy komplementarnej nici DNA jest większa niż degradacja RNA związana z jej aktywnością jednak jej niska aktywność sprzyja dobrej wydajności reakcji.

Aktywność RNAzy H – przejawia się specyficzną degradacją nici RNA w hybrydach RNA:DNA. Aktywność RNAzy H może nie wywierać znaczącego wpływu na ilość DNA, jeżeli całość syntezy komplementarnej nici DNA jest większa niż degradacja RNA związana z jej aktywnością. Jest niezbędna, ale powinna być szczególnie wysoka. Wszystkie rodzaje RNA (rRNA, tRNA, mRNA) ulegają przepisaniu na cDNA, a dopiero w reakcji amplifikacji ze specyficznymi starterami dla badanego genu dochodzi do wybiórczej syntezy specyficznego produktu.

Na co należy zwracać uwagę przygotowujac reakcję odwrotnej transkrypcji:

- wielkość produktu. (najczęściej od 200-5000pz)

- dobór starterów do reakcji PCR (powinny być zlokalizowane na granicy dwóch różnych eksonów, aby uniemożliwić syntezę na matrycy DNA. Najczęściej składają się z 22-30 nukleotydów o mniej więcej równej zawartości AT/GC)

- weryfikacja produktu (produkt reakcji powinien zostać potwierdzony innymi technikami takimi jak: sekwencjonowanie, hybrydyzacja z sondami komplementarnymi do analizowanego fragmentu, analiza restrykcyjna). 

Porównanie korzyści wynikających z prowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji w jednym i dwóch etapach.